一、 FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)功能特點(diǎn)

由于葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)本身在科學(xué)研究中有一系列的局限性。因此從上世紀(jì)八十年代末開始，隨著Charge-Coupled Device(CCD)成像技術(shù)、LED光源板技術(shù)、圖像分析技術(shù)的成熟，不斷有科學(xué)家和工程師合作探索將這三項(xiàng)技術(shù)與PAM脈沖調(diào)制技術(shù)結(jié)合，進(jìn)而將葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)升級(jí)為葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)（Daley et al. 1989; Raschke et al. 1990; Mott et al. 1993; Genty and Meyer 1994; Bro et al. 1995; Siebke and Weis 1995; Meyer and Genty 1998; Balachandran et al. 1994; Oxborough and Baker 1997）。

20世紀(jì)90年代末，PSI科學(xué)家Nedbal和PSI總裁Trtilek等合作，成功研制了與PAM脈沖調(diào)制技術(shù)結(jié)合的FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)（Nedbal et al., 2000），并推出第一臺(tái)商業(yè)化葉綠素?zé)晒獬上裨O(shè)備FluorCam。

這一發(fā)明正式開啟了葉綠素?zé)晒庋芯康亩S時(shí)代。FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)成為上世紀(jì)90年代葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的重要突破，使科學(xué)家們對(duì)光合作用與葉綠素?zé)晒獾难芯恳幌伦舆M(jìn)入二維世界，并得到了國際科學(xué)界的一致認(rèn)可。

與之前的葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)相比，FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的主要優(yōu)勢(shì)有：

· 能夠全面反映整株植物、葉片、藻類群體等的不同位置熒光強(qiáng)度變化與分布。

· 可測量葉片、果實(shí)、麥穗、大型藻/微藻、整株植物乃至植物冠層等各種樣品。

· 可同時(shí)測定幾十、甚至上百株個(gè)樣品。

· 能夠在顯微水平研究葉綠體或藻類細(xì)胞。

· 尤其適用于環(huán)境脅迫早期植物不同部位光合活性的變化規(guī)律、突變體不同部位的光合功能差異等研究。

同時(shí)，FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)與同類技術(shù)相比具備以下優(yōu)勢(shì)：

· 由真正的生物學(xué)家、數(shù)學(xué)家、電子工程師和光學(xué)工程師組成的研發(fā)團(tuán)隊(duì)所開發(fā)

· FluorCam是脈沖調(diào)試式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的最早實(shí)用化成果

· 國際葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，僅2019-2021.3可查閱全文的SCI文獻(xiàn)就有300篇以上

· 可實(shí)現(xiàn)高通量植物表型分析、抗性篩選、種質(zhì)資源檢測等科研應(yīng)用

· 激發(fā)熒光的LED光源板和獲取熒光數(shù)據(jù)的成像傳感器不但技術(shù)而且為PSI自行開發(fā)，具備*自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)

· 測量及成像參數(shù)最多，具備葉綠素?zé)晒怙@微成像、OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線、QA再氧化動(dòng)力學(xué)、熒光蛋白活體成像、多光譜熒光成像、無人值守自動(dòng)監(jiān)測、圖像閾值分割等世界的成像測量功能

· 以FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)為核心的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)為目前安裝最多的植物表型組學(xué)研究系統(tǒng)

· 軟件由PSI開發(fā)，為客戶提供升級(jí)服務(wù)

· PSI表型科研中心可進(jìn)行科研合作并提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

· 系統(tǒng)型號(hào)全面，適用于各種實(shí)驗(yàn)需求

· 幾乎無維護(hù)費(fèi)用

技術(shù)功能特點(diǎn)：

1) 儀器型號(hào)和配置靈活多樣，測量樣品涵蓋了從葉片、藻類、果實(shí)、花朵、整株植物、植物群體/冠層乃至單個(gè)微藻/植物細(xì)胞、葉綠體等幾乎所有不同類型的宏觀和微觀植物樣品，甚至還包括含有葉綠素的細(xì)菌和海洋生物；同時(shí)滿足了從實(shí)驗(yàn)室光合機(jī)理精細(xì)研究到野外大田實(shí)地研究，從自然環(huán)境到精確可控環(huán)境等不同實(shí)驗(yàn)條件和尺度的要求。

2) 高靈敏度CCD，時(shí)間分辨率可達(dá)50幀／秒，分辨率720×560像素；可選配高分辨率CCD，最高分辨率1360×1024像素，在最高圖像分辨率下時(shí)間分辨率可達(dá)20幀／秒，用于穩(wěn)態(tài)熒光如GFP熒光測量等；超高靈敏度成像傳感器，最高分辨率1280×1024像素，最高時(shí)間分辨率高達(dá)16000幀／秒，真正實(shí)現(xiàn)了OJIP快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的成像測量

3) 具備完備的自動(dòng)測量程序（protocol），可自由對(duì)自動(dòng)測量程序進(jìn)行編輯

a) Fv/Fm：測量參數(shù)包括Fo，Fm，Fv，QY等

b) Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等熒光參數(shù)

c) 熒光淬滅分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY，Φ_II，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多個(gè)參數(shù)

d) 光響應(yīng)曲線：Fo，Fm，QY，QY_Ln，ETR等熒光參數(shù)

e) PAR吸收率、NDVI成像測量（選配）

f) GFP、YFP、EBFP、CFP、DsRed等熒光蛋白與DAPI等熒光染料的熒光定量測量（選配）

g) 多光譜熒光測量（選配）：F440、F520、F690、F740

h) QA再氧化動(dòng)力學(xué)曲線（選配）

i) OJIP快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（選配）：Fo，Fj，Fi，P或Fm，Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積、Sm（對(duì)關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度）、QY、PI等參數(shù)

4) 自動(dòng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)功能，可無人值守自動(dòng)循環(huán)完成選定的實(shí)驗(yàn)程序，重復(fù)次數(shù)及間隔時(shí)間客戶自定義，成像測量數(shù)據(jù)自動(dòng)按時(shí)間日期存入計(jì)算機(jī)

5) 標(biāo)配4個(gè)LED光源板，采用大型預(yù)封裝LED光源，紅/藍(lán)或紅/白雙色光化光源，可選配其他不同顏色（波長）、不同光強(qiáng)LED光源

6) 功能強(qiáng)大的FluorCam葉綠素?zé)晒獬上穹治鲕浖δ埽壕?/span>Live（實(shí)況測試）、Protocols（實(shí)驗(yàn)程序選擇定制）、Pre–processing（成像預(yù)處理）、Result（成像分析結(jié)果）等功能菜單：

7) 數(shù)據(jù)分析具備“信號(hào)計(jì)算再平均"模式（算數(shù)平均值）和“信號(hào)平均再計(jì)算模式"兩種功能模式，在高信噪比的情況下選用“信號(hào)計(jì)算再平均"模式，在低信噪比的情況下選擇“信號(hào)平均再計(jì)算"模式以過濾掉噪音帶來的誤差

8) 輸出結(jié)果：高時(shí)間解析度熒光動(dòng)態(tài)圖、熒光動(dòng)態(tài)變化視頻、熒光參數(shù)Excel文件、直方圖、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

二、 FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)型號(hào)

1. FluorCam便攜式葉綠素?zé)晒獬上駜x

· 可測量葉綠素?zé)晒獬上瘢蛇x配GFP熒光蛋白成像功能

· 成像面積：便攜式FluorCam 31.5mm×41.5 mm、便攜式GFPCam 35mm×46 mm

· 配備專用支架和電池包，便攜性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)室、野外均可使用

· 可編輯測量實(shí)驗(yàn)程序（protocol）

· 具備自動(dòng)重復(fù)測量功能

· 配備專用暗適應(yīng)葉夾，便于在野外對(duì)樣品進(jìn)行暗適應(yīng)無損測量

2. FluorCam封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)

· FluorCam系列中功能全面，使用便捷的型號(hào)

· 系統(tǒng)集成于暗適應(yīng)操作箱內(nèi)，操作簡便、便于移動(dòng)，既可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)也可在室外進(jìn)行暗適應(yīng)成像測量分析

· 高靈敏度CCD鏡頭，時(shí)間分辨率達(dá)50張每秒，快速捕捉葉綠素?zé)晒馑沧?；可選配高分辨率CCD用于穩(wěn)態(tài)熒光如GFP熒光測量；也可選配超高靈敏度成像傳感器，實(shí)現(xiàn)真正的OJIP快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線成像測量

· 成像面積達(dá)13×13cm，可對(duì)植物葉片、植物組織、藻類、苔蘚、地衣、整株植物或多株植物、96孔板、384孔板等進(jìn)行成像分析

· 飽和光光強(qiáng)最高達(dá)6000 µmol(photons)/m2.s，進(jìn)行QA再氧化分析使用的單周轉(zhuǎn)飽和光閃STF可達(dá)120000µmol(photons)/m2.s

· 世界上可進(jìn)行OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)成像分析的葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)設(shè)備

· 世界上可進(jìn)行QA再氧化動(dòng)力學(xué)成像分析的葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)設(shè)備

· 具備功能的、可編輯的葉綠素?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)程序（Protocols），包括快照模式、Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、葉綠素?zé)晒獯銣绶治觥?/span>LC光響應(yīng)曲線、PAR吸收與NDVI成像分析、QA再氧化動(dòng)力學(xué)分析、OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)分析及GFP綠色熒光蛋白成像等

· 可選配GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等熒光蛋白與熒光染料成像

· 可進(jìn)行自動(dòng)重復(fù)成像測量分析

· 4塊大型高強(qiáng)度封裝LED光源板，具備雙色光化光，標(biāo)配為2紅光+2白光，可選配2紅光+2藍(lán)光或其它波長光源組合

3. FluorCam開放式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)

· 模塊化設(shè)計(jì)，配置靈活，可自由安裝更換光源板、自由調(diào)整光源角度和高度、自由調(diào)整CCD鏡頭高度，方便被測植物的處理、操作等

· 4塊大型高強(qiáng)度封裝LED光源板，具備雙色光化光，標(biāo)配為2紅光+2白光，可選配2紅光+2藍(lán)光或其它波長光源組合

· 可自由選配多種備用不同波長LEDs光源板，用戶可簡便自行更換，如選配青色光源板用于氣孔功能研究、選配紫外光源板用于多光譜熒光成像測量等

· 可進(jìn)行GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等熒光蛋白與熒光染料成像

· 標(biāo)準(zhǔn)版成像面積13×13cm，大型版成像面積達(dá)20×20cm，可對(duì)整株植物甚至多株植物（如擬南芥等小型植物）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)成像分析

· 高靈敏度CCD鏡頭，時(shí)間分辨率達(dá)50張每秒，快速捕捉葉綠素?zé)晒馑沧?，可選配高分辨率CCD用于穩(wěn)態(tài)熒光如GFP熒光測量

4. FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)

FluorCam多光譜成像系統(tǒng)是將穩(wěn)態(tài)熒光成像技術(shù)與脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)融于一體，能夠在一臺(tái)儀器上實(shí)現(xiàn)GFP、BFP、CFP、YFP、RFP等熒光蛋白成像、DAPI等熒光染料成像、熒光素酶、脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上褚约?/span>NDVI反射光譜成像分析功能，是真正功能全面的植物熒光活體成像系統(tǒng)。同時(shí)，除了植物樣品外，植物熒光活體成像系統(tǒng)也可以進(jìn)行藻類、珊瑚共生體、菌落乃至動(dòng)物的熒光成像分析。

· 1360×1024像素高分辨率CCD，可對(duì)樣品熒光標(biāo)記的分布進(jìn)行精準(zhǔn)成像分析

· 標(biāo)準(zhǔn)版成像面積13×13cm，大型版成像面積達(dá)20×20cm，可對(duì)整株植物甚至多株植物（如擬南芥等小型植物）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)成像分析

· 專用熒光激發(fā)光源組與濾波器組合，精確測量不同熒光蛋白標(biāo)記

· 軟件配置多種用戶自定義調(diào)色板，可生成真實(shí)色彩成像圖或?qū)Ρ仍鰪?qiáng)彩色成像圖

· 可選配新型FluorCam-Pro植物多光譜熒光成像系統(tǒng)，一體化完成各種熒光成像測量  

5. FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)

· 目前用于植物/藻類顯微葉綠素?zé)晒獬上裱芯康某墒焐逃脙x器

· 內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素?zé)晒庋芯康娜砍绦?，?/span>Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等，可獲得70余項(xiàng)參數(shù)

· 配備10倍、20倍、40倍、63倍和100倍專用生物熒光物鏡，可以清晰觀測到葉綠體及其發(fā)出的熒光

· 激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光、藍(lán)光、綠光、白光、紫外光和遠(yuǎn)紅光等，通過紅藍(lán)綠三色光還可以調(diào)出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類中任何一種色素分子或發(fā)色團(tuán)。

· 可進(jìn)行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析

· 高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖

· 控溫系統(tǒng)可以保證實(shí)驗(yàn)樣品在同等溫度條件下進(jìn)行測量，提高實(shí)驗(yàn)精度，也可以進(jìn)行高溫/低溫脅迫研究

6. FluorCam大型葉綠素?zé)晒獬上衿脚_(tái)

· 世界上單幅成像面積最大的脈沖調(diào)制式（PAM）葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，成像光源板面積70×70cm，成像面積達(dá)35×35cm，可對(duì)整株植物及多株植物同時(shí)進(jìn)行非損傷性葉綠素?zé)晒獬上穹治?/span>

· LED激發(fā)光源、CCD葉綠素?zé)晒獬上耒R頭及濾波輪等集成于一個(gè)高度可自由移動(dòng)的成像平臺(tái)上，成像平臺(tái)高度可調(diào)，以適應(yīng)于不同高度的植物成像分析

· 可選配PAR吸收／NDVI成像分析模塊，對(duì)植物PAR吸收及光譜反射指數(shù)NDVI進(jìn)行成像分析

· 可選配RGB成像分析模塊,用于植物形態(tài)測量分析等

· 可選配GFP綠色熒光蛋白成像分析功能，用于植物轉(zhuǎn)基因研究

三、FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)應(yīng)用案例

1. 擬南芥葉綠體R-loop調(diào)控機(jī)制

2017年清華大學(xué)生命學(xué)院孫前文課題組通過分析獲得一個(gè)新的定位于葉綠體中的核糖核酸酶H蛋白（AtRNH1C），發(fā)現(xiàn)該蛋白可以調(diào)節(jié)葉綠體中R-loop水平的變化，從而維持基因組的穩(wěn)定性和發(fā)育。他們使用FluorCam封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，發(fā)現(xiàn)AtRNH1C對(duì)葉綠體的發(fā)育有重要作用。

在使用喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星（CIP）處理后，通過FluorCam葉綠素?zé)晒獬上駡D可以直觀發(fā)現(xiàn)野生型的生長被抑制，同時(shí)葉片變色。而atrnh1c突變體則加強(qiáng)了CIP的毒害效應(yīng)。這更加證實(shí)了AtRNH1C的功能。本實(shí)驗(yàn)的熒光成像檢測是在易科泰Ecolab實(shí)驗(yàn)室完成的。

2020年，孫前文課題組又使用FluorCam封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)結(jié)合分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了R-loop解旋酶過表達(dá)能夠拯救由于異常累積HO-TRC觸發(fā)R-loop共同表達(dá)造成的缺陷，從而維持?jǐn)M南芥葉綠體基因組完整性。

參考文獻(xiàn)：

1. Yang Z, et al. 2017. RNase H1 Cooperates with DNA Gyrases to Restrict R-loops and Maintain Genome Integrity in Arabidopsis Chloroplasts. The Plant Cell, doi:10.1105/tpc.17.00305

2. Yang Z, et al. 2020. RHON1 Co-transcriptionally Resolves R-Loops for Arabidopsis Chloroplast Genome Maintenance. Cell Reports 30: 243–256

2. 構(gòu)建耐鹽生菜品種表型鑒定體系

目前，全球農(nóng)業(yè)都受到土壤和灌溉水鹽分升高的威脅。大約50%的灌溉農(nóng)田都受到了鹽分的影響。2013年的經(jīng)濟(jì)分析指出由于鹽分誘發(fā)的土壤退化和作物產(chǎn)量損失在全球造成了273億美元的損失。作為一種重要的蔬菜作物，生菜（Lactuca sativa L.）在世界范圍內(nèi)都進(jìn)行了廣泛的種植。生菜產(chǎn)量最高的國家為美國、歐盟和中國。而生菜對(duì)鹽分脅迫非常敏感的。鹽分脅迫會(huì)造成生菜生物量減少、誘發(fā)葉燒病和早衰等。

美國農(nóng)業(yè)部（USDA）的科學(xué)家嘗試確定生菜鹽脅迫的關(guān)鍵生理表型性狀，用于篩選高耐鹽的生菜品種，希望從這些數(shù)據(jù)中篩選出的指標(biāo)構(gòu)建耐鹽生菜品種表型鑒定體系。與傳統(tǒng)作物表型測量相比，一方面光系統(tǒng)對(duì)各種生物和非生物脅迫因素都非常敏感，而葉綠素?zé)晒獬上穹治隹梢詿o損地直接測量脅迫對(duì)光系統(tǒng)的損傷程度和機(jī)理，在脅迫初期乃至癥狀出現(xiàn)前即可檢測到脅迫的發(fā)生；另一方面，葉綠素?zé)晒獬上穹治黾夹g(shù)與自動(dòng)傳送系統(tǒng)集合，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大量樣品的高通量無損快速檢測，非常適用于作物品種的篩選。他們使用的PlantScreen XYZ植物表型成像分析系統(tǒng)就能夠?qū)⑦@兩方面的優(yōu)勢(shì)地結(jié)合起來。其樣帶式FluorCam葉綠素?zé)晒獬上駟卧?/span>是目前使用脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)實(shí)現(xiàn)大型整株植物測量的商用化儀器。自動(dòng)傳送系統(tǒng)可以自動(dòng)調(diào)整成像單元的位置與高度，結(jié)合專用軟件可以對(duì)幾十株乃至上百株樣品進(jìn)行自動(dòng)葉綠素?zé)晒獬上穹治觥?/span>

實(shí)驗(yàn)中使用了球生菜、奶油生菜、直立生菜、葉生菜等不同的栽培品種和生菜的野生親緣種L. serriola L，共240株樣品。這些品種中既有耐鹽品種，也有鹽脅迫敏感品種。所有樣品在同樣鹽脅迫處理下進(jìn)行了葉綠素?zé)晒獬上穹治?。研究者重點(diǎn)分析了QY_max（Fv/Fm）最大光化學(xué)效率、Fv/Fm_L（Fv’/Fm’）光適應(yīng)最大光化學(xué)效率、NPQ非光化學(xué)淬滅（最大熒光）、qN非光化學(xué)淬滅（可變熒光）、qP光化學(xué)淬滅、QY實(shí)際光化學(xué)效率（量子產(chǎn)額）、Rfd熒光衰減比率等熒光參數(shù)。

值得一提的是，葉綠素?zé)晒獬上駡D經(jīng)過校準(zhǔn)后，還可以直接獲得整株植物具備光合活性的葉面積。結(jié)合熒光參數(shù)還可以對(duì)葉面積進(jìn)行不同脅迫程度的定量分級(jí)和圖像分割。本研究中直接使用葉綠素?zé)晒獬上瘾@得的光合活性葉面積取代了傳統(tǒng)測量的葉面積。

熒光數(shù)據(jù)與鮮重等傳統(tǒng)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析和主成分分析，結(jié)果表明敏感栽培種的葉綠素?zé)晒馓卣魇堑?/span>QY，qN，NPQ和Rfd，而耐受栽培種的特征是高QY_max，Fv/Fm_L和QY_D。與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的高靈敏度相比，大多數(shù)樣品的葉綠素指數(shù)和CO₂同化速率在鹽脅迫處理前后都沒有表現(xiàn)出顯著的差異。因此，研究者建議在篩選高耐受品系時(shí)以較高的葉面積配合較高的Fv/Fm和QY作為初篩指標(biāo)。

后續(xù)，美國農(nóng)業(yè)部又使用加裝了高光譜成像單元的PlantScreen表型成像系統(tǒng)與FluorCam結(jié)合，通過葉綠素?zé)晒獬上駭?shù)據(jù)與高光譜成像數(shù)據(jù)繪制了生菜水分脅迫響應(yīng)基因位點(diǎn)的分子圖譜。

參考文獻(xiàn)：

1. Adhikari N D, et al. 2019. Phenomic and Physiological Analysis of Salinity Effects on Lettuce. Sensors, 19: 4814

2. Kumar P, et al. 2021. Molecular Mapping of Water-Stress Responsive Genomic Loci in Lettuce (Lactuca spp.) Using Kinetics Chlorophyll Fluorescence, Hyperspectral Imaging and Machine Learning. Front. Genet. 12: 634554